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PSC를 Essential 8 Medium와 Vitronectin에 적응시키는 방법

716 views · Published 20 February 2013 · 4:37 · Indexed 18 October 2026

Channel: Thermo Fisher Scientific · 2013 · Science & Technology

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이 비디오에서는 feeder있는 상태거나 feeder없는 배지에 적응된 PSC를 Essential 8 Medium와 Vitronectin에 적응시키는 방법을 알려드리고자 합니다. Essential 8™ Medium는 보충액이 필요없는(feeder-free) 성분이 완전히 제조된 배지로 인간 만능 줄기세포(PSC) 성장과 확장에 맞게 만들어졌습니다. 이는 원래 James Thomson 실험실에서 E8 Medium로 개발되었던 제품으로 Cellular Dynamics International에서 검증하였습니다. Essential 8™ Medium는mTeSR나 StemPro hESC SFM 같은 다른 feeder-free media와 달리 로트간 변동성을 일으키는 BSA (소혈청 알부민)이 필요하지 않습니다. 또한 다른 무혈청 배지는 20개 이상의 성분으로 이루어져 복잡하고 시간과 비용이 많이 드는 반면, Essential 8™ Medium는 단 8가지 성분으로만 이루어져 있습니다. Matrigel™-코팅 배양 용기에서 mTeSR™ Medium를 사용해 성장한 PSC는 vitronectin 코팅 배양 용기에 든 Essential 8™ Medium 에 직접 해동시킬 수 있습니다. 동결 전에 KnockOut™ Serum Replacement feeder에 유지된 PSC는 KSR Medium MEF feeder 층에서 해동해야 합니다. 그리고 이 세포를 회수한 후 계대배양 시약으로 EDTA를 사용하여 vitronectin 코팅 배양 용기의Essential 8™ Medium에서 계대배양 할 수 있습니다. Essential 8에 직접 해동하는 경우 50mL 시험관에 Essential 8™ Medium 10 mL를 넣고 실온에 맞춥니다. 그리고 vitronectin 코팅 6웰 플레이트의 적정량을 실온에 맞춥니다. 금속 집게를 이용해 액체 질소 저장소에서 PSC 바이알을 꺼내 드라이아이스에 넣어 세포 배양 후드로 옮깁니다. 
이 바이알을 37°C 수조에 넣고 부드럽게 흔듭니다. 단, 뚜껑이 잠기지 않게 합니다. 얼음 결정이 남아있을 때 수조에서 바이알을 꺼냅니다. 바이알 바깥쪽에 70% 에탄올을 스프레이로 뿌리고 후드에 둡니다. 5mL 멸균 피펫을 사용해 세포를 멸균 50mL 원뿔형 시험관에 조심스럽게 옮깁니다. Essential 8™ Medium 10 mL을 한 방울씩 천천히 이 50mL 원뿔형 시험관의 세포에 첨가합니다. 배지를 넣는 동안 시험관을 앞뒤로 부드럽게 흔들며 PSC를 섞습니다. 이는 세포의 삼투압 쇼크를 줄여줍니다. 바이알을 Essential 8™ Medium 1mL로 행구고 세포가 들어있는 50-mL 시험관에 넣습니다. 내용물을 15mL 시험관으로 천천히 옮깁니다. 세포를 200중력가속도(g) 5분간 원심분리합니다. 상층액을 빼내서 버립니다. 시험관 안에 피펫을 넣고 세포를 몇 번 위 아래로 빨아올렸다 내렸다 하며 Essential 8™ Medium 2 mL에서 세포 펠릿을 재현탁합니다. 실온으로 맞추어 놓은 vitronectin 코팅 플레이트에서 vitronectin을 빼냅니다. PSC 현탁액을 vitronectin 코팅 플레이트에 천천히 첨가합니다. 해동 세포 바이알 1개를 6웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 배양 접시를 37°C, 5% CO2 배양기에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 접시로 빨리 8자를 그리며 세포가 웰 표면 전반에 퍼지게 합니다. 다음날, 사용한 배지를 새로운 complete Essential 8™ Medium로 바꿉니다. 세포 confluency가 약 85%가 될 때까지 매일 배지를 교체합니다.

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