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Ask TaqMan ®: Ep. 3 TaqMan® 프로브에는 어떤Quencher분자가 가장 좋을가?

2,717 views · Published 26 October 2012 · 4:10 · Indexed 26 October 2026

Channel: Thermo Fisher Scientific · 2012 · Education

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Real-Time PCR에 대한 사용자 여러분의 질문을 등록하시면 라이프 테크놀로지스의Sr. Field Application Specialist인 Doug Rains이 도와드립니다. 

[Script]
여러 해 동안 저는 "TaqMan® 프로브에는 어떤 제거물질, 즉 퀜차 분자가 가장 좋은가"라는 질문을 받고 있습니다. 좋은 질문입니다.
우선 어떤 제품을 이용할 수 있는지 살펴보겠습니다. Applied Biosystems® 의 실시간 분석기에는 공식적으로 두 가지 퀜차를 사용할 수 있습니다. 그 중 하나가 오래되었지만 그 품질을 인정받는 TAMRA™ dye입니다. TAMRA™ dye는 오래 동안 사용되어 왔으며 여전히 널리 사용되고 있습니다. 예를 보십시오. 이것은 프로브를 디자인하려하는 표적 시퀀스입니다. 그리고 이것이 프로브입니다.
FAM™ 리포터가 5번 말단에 있지요. TAMRA™ dye가 3번 말단에서 퀜칭을 합니다. 이제 프로브가 기능을 합니다. 그런데 TAMRA™ dye를 퀜차로 사용하는 데는 몇 가지 문제가 있습니다. 첫 번째로 TAMRA™ dye는 그 자체가 형광 분자인데 형광분자는 배경 신호를 발생시킵니다. 이 형광을 따로 측정해야 하기 때문에 필터 기반 기기 염료 슬롯 하나를 TAMRA™ dye에 할당해야 합니다. 하지만 대개 남는 필터가 있기 때문에 별 문제는 아닙니다. 이 보다 큰 문제는 TAMRA™ dye로 퀜칭한 프로브의 길이가 길다는 데 있습니다. 프로브는 섭씨 약 70도 이하의 녹는점을 가져야 하는데 그렇게 하기 위해서는 프로브 길이가 35bp나 40bp 이상이어야 합니다. 잠시 후 보겠지만 프로브 길이가 길면 대개 특이성이 떨어집니다. 네, 짧은 프로브보다 특이성이 낮지요. 이에 대해서는 잠시 후에 설명하겠습니다. 우선 상대적으로 새로운 제품인 MGB 프로브를 살펴봅시다. MGB 프로브의 3번 분자는 실제로 서브유닛 두 개로 이루어집니다. 이게 퀜차지요. TAMRA™ dye와 달리 형광을 띠지 않기 때문에 배경 형광을 발생시키지 않습니다. 좋은 점이죠. 그리고 MGB 즉, minor groove binder 라고 하는 두 번째 서브유닛이 프로브의 녹는점을 높이는 역할을 합니다. 이 때문에 짧으면서 보통 특이성이 더 높은 프로브를 디자인할 수 있습니다. MGB로 좀 전의 프로브를 다시 디자인하면 TAMRA™ dye로 퀜칭한 프로브보다 훨씬 짧아지지요. 절반도 되지 않습니다. MGB는 프로브와 템플릿을 꽉 잡아주는 클램프 역할을 합니다. 그러면 말씀드린 바와 같이 특이성이 높아지게 됩니다. 이 말은 확 와닿지 않을 수 있습니다. 설명하자면 프로브를 디자인하고자 하는 표적 시퀀스가 있다고 합시다. 우선 이 시퀀스를 이와 동일한 유기체에 알고 있는 모든 전사 시퀀스에 대해 과학적으로 BLASTing합니다. 이 시퀀스가 고유한지 알아보는 것이지요. 음, 여기에는 매우 유사한 시퀀스가 하나 있군요. 같은 유전자 계열로 보이는데 염기 2개만 다릅니다.
이제, TAMRA™ dye 퀜치 프로브를 디자인해 봅시다. 문제없이 표적에 결합할 것입니다. 그런데 35개 가량의 염기 중 2개만 다르기 때문에 이 프로브는 표적이 아닌 시퀀스에 결합할 수 있습니다. 그래서 효율성이 떨어지며 PCR 중에 잘못된 시퀀스를 갖게 될 것입니다. MGB로 프로브를 다시 디자인해 봅시다. 물론 길이가 훨씬 짧아지죠. 그렇기 때문에 미스매치 2개는 전체 길이로 봤을 때 그 비율이 커집니다. 그래서 프로브가 표적에는 확실히 결합하며 미스매치 시퀀스에는 친화성이 훨씬 떨어집니다. 좋지요.
이 정보가 도움이 되었길 바랍니다. 저희에게 언제든 실시간 PCR 질문을 보내주세요. 운이 좋다면 다음 시간에 여러분의 질문이 선택될 수도 있습니다.

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