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멀티플렉스 qPCR 실험의 최적화방법 - Ask TaqMan #18

1,102 views · Published 10 June 2014 · 4:14 · Indexed 26 October 2026

Channel: Thermo Fisher Scientific · 2014 · Science & Technology

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TaqMan은 강건하고 특이성이 높으며, 또 추가하자면 활용도가 높은 실시간 PCR 화학입니다. 사용자는 TaqMan 프로브를 여러가지 염료로 라벨링하여 한 웰에서 하나 이상의 표적을 멀티플렉싱할 수 있습니다. 이에 대한 'TaqMan에게 물어봐' 비디오에서 멀티플렉싱의 장점에 대해 이야기했습니다. 이번 비디오에서는 이 기술에 대한 큰 위험을 논의하고 이와 관련된 캐나다 심혈관학회의 Rushita의 질문에 답하겠습니다. 질문은 "멀티플렉스 실험을 표준화하는 비용효율적인 최선책은 무엇인가요?" 입니다.
몇 가지 기본 사항을 살짝 짚고 넘어가겠습니다. 싱글플렉스 유전자 발현 실험에서 저는 항상 표적과 내재 대조 분석물을 별도의 웰에서 증폭시킵니다. 하지만 이들을 한 웰에 넣고자 한다면, 기기가 구별할 수 있는 두 가지 다른 염료로 분석 프로브 2개를 라벨링해야 합니다. 바로 FAM과 VIC입니다.
이젠 두 프로브를 한 웰에 넣고 증폭한 후 싱글플렉스 실험과 데이터를 비교하겠지요. 맞나요? 아마도 그렇겠지만, 여기 문제가 있습니다.
두 분석물을 한 웰에 넣으면 효소와 dNTP를 포함한 동일한 공통 시약 풀이 있어야 합니다. 만약 한 유전자, 대개 정상화 유전자가 훨씬 쉽게 반응한다면 두 번째 유전자가 amp 플롯에 나타나기도 전에 이미 선형기와 안정기가 나와있을 수 있습니다. 그렇기 때문에 표적 유전자는 dNTP 같은 공통 시약이 부족해지고 증폭이 부실해질 수 있겠지요.
다행히 조정을 통해 이 문제를 해결할 수 있습니다. 소위 정상화 유전자 프라이머 제한이라고 하는데요. Normalizer assay의 프라이머 농도를 현저히 줄인다면 안정기에 훨씬 일찍 도달하겠지요. 이것은 dNTP가 아니라 자체의 프라이머를 다 써버렸기 때문입니다.  이론과 종종 실제에서도 표적 유전자 분석물이 적절히 증폭하기에 충분한 공통 시약이 웰에 남아있게 됩니다.
라이프 테크놀로지스는 듀플렉스 유전자 발현 실험을 위한 VIC 라벨, 프라이머 제한 내재 대조 분석물을 판매합니다. 이런 듀플렉스 유전자 발현용 분석물 중 하나로 시작하라고 제안합니다. 여전히 몇 가지 검사를 통해 통합 분석이 최종 결과에 영향을 미치지 않는다고 보장할 필요는 있습니다. 제 제안은 샘플 몇 개, 한 개의 미처리 샘플과 처리 샘플을 각각 대여섯개 취한 후 싱글플렉스와 듀플렉스에서의 분석물로 모두를 증폭해 보십시오. 그리고 배수 변화 데이터를 계산합니다. 샘플 간 결과가 두 그룹 간에 일치하면 멀티플렉싱이 결과에 부정적인 영향을 미치지 않은 것입니다. 하지만 샘플 간 결과가 일치하지 않는다면 굳이 위험을 무릅쓸 필요는 없겠지요.
마지막 기술적인 사항 하나는 대부분의 리얼타임 기기가 다중 필터 세트를 가지고 있어 여러 분석물을 한 웰에 통합할 수 있다고 제안합니다. 하지만 조심하십시오. 반응에 추가하는 표적이 많아지고 이들 간 상호작용이 복잡해 질수록 최종 데이터가 왜곡될 위험이 커집니다. 기억할 점은 여러 샘플의 결과를 비교해보고 시작 RNA 농도 범위를 넓게 하여 멀티플렉스를 검증해야 멀티플렉스 데이터를 확실히 믿을 수 있다는 것입니다.
실시간 멀티플렉싱에 대해 더 알아보고 싶다면 lifetechnologies.com에서 "멀티플렉스 실시간 PCR에 영향을 주는 요인"이라는 제목의 어플리케이션을 검색해보세요.
실시간 PCR에 대해 질문이 있으세요? TaqMan®에게 물어보세요. #askTaqman으로 트위터하거나 페이스북으로 찾아보세요. 아니면 http://lifetechnologies.com/askTaqMan 웹사이트로 오셔도 됩니다.

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