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Ask TaqMan ®: Ep. 5 Real-Time PCR의 베이스라인

3,853 views · Published 26 October 2012 · 4:10 · Indexed 21 September 2026

Channel: Thermo Fisher Scientific · 2012 · Education

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Real-Time PCR에 대한 사용자 여러분의 질문을 등록하시면 라이프 테크놀로지스의Sr. Field Application Specialist인 Doug Rains이 도와드립니다. 

[Script]
안녕하세요. 'TaqMan에게 물어봐'입니다. 트위터나 페이스북, 라이프테크놀로지스 홈페이지를 통해 보내주신 실시간 PCR에 대한 질문에 답해 드립니다. 오늘의 질문은 "베이스라인이란 무엇인가 그리고 과연 신경써야 하는가?" 입니다. 
네. 신경쓰셔야 합니다. 그 이유를 설명해 드리죠. 이것은 매우 일반적인 표준 실시간 증폭 곡선입니다. 예쁜 곡선들이 있지요. 모두 익숙하게 기하학 부분과 선형 부분, 편평한 부분이 있습니다. 지금까지는 좋습니다. 그런데 이 앞부분에 있는 지저분한 것들은 무엇인가요? 여러분들도 지저분하다고 말했다면, 맞습니다. 지저분하고 쓸모없는 부분, 잡음, 노이즈라고 하지요. 이런 모양은 실제 증폭 신호가 노이즈를 무시할 수 있을 정도로 커지기 전에 나타납니다. 그리고 방금 지저분하고 쓸모없다고 말했듯이 우리에게 전혀 필요없는 부분입니다. 그럼 그냥 무시해버릴 수 있을까요? 그건 아닙니다. 이런 노이즈는 곡선에 영향을 미칩니다. 우리의 역할은 노이즈를 효과적으로 차감시켜 그 영향을 최소화하는 것이지요. 그렇게 하기 위해 베이스라인, 즉 주기와 주기 사이 실제 곡선이 나타나기 전에 노이즈만 있는 범위를 설정합니다. 그러면 소프트웨어에서 웰 하나하나에서의 노이즈를 효과적으로 차감해 데이터 품질을 크게 높여줍니다.
이제 Y축을 선형 척도로 바꾸어 베이스라인 차감 효과를 그림으로 살펴봅시다. 이것은 베이스라인 작업 전 데이터입니다. Y축에서 각 샘플의 시작점이 약간씩 차이가 있지요. 여기가 기하학 부분 데이터입니다. 그리고 휘어진 부분을 보면 정말 복잡합니다.
하지만 노이즈를 차감하면 모든 샘플이 0에서 동일하게 시작하고 데이터가 깔끔하게 나타납니다.
배경 노이즈를 정규화한 후에 얻는 값을 델타 Rn이라고 합니다. 증폭 곡선을 우리가 늘상 보는 로그 그래프로 그리면 Y축이 델타 Rn입니다. 그런데 델타 Rn에서 "N"은 무엇인가요? 그것은 ROX에서 나옵니다. TaqMan에게 물어봐 다른 시간에서 설명했는데요. 보지 않으셨다면 보시기 바랍니다. 
이번 시간의 마지막으로 Applied Biosystems®의 실시간 PCR 소프트웨어에서 베이스라인을 설정하는 방법 두 가지를 알려드리겠습니다. 수동 설정과 자동 설정이 있는데 수동 설정은 분석 설정 메뉴에서 베이스라인 범위를 설정합니다. 분석 별로 한 값을 설정해 모든 웰에 적용시키거나 고급 설정으로 들어가 웰마다 각각 설정할 수 있습니다. 그보다 편리하게 자동 베이스라인 기본 설정을 이용할 수 있습니다. 여기를 선택하면 소프트웨어에서 알아서 각 웰에 적합하게 노이즈를 차감시킵니다. 그래서 전반적으로 최고의 결과를 제공하지요. 그럼 수동 설정 기능이 있는 이유는 무엇일까요? 자동 설정이 적합하지 않은 경우가 있기 때문입니다. 특히 일부 SYBR® Assay와 비표준 화학물질 작업의 경우가 그렇습니다. 곡선 모양으로 자동 설정이 잘못되었는지 알 수 있는데요. 여기가 원래 보다 많이 휘어져 있으면 베이스라인이 잘못 적용되어 주기 종료점이 너무 낮게 설정된 것입니다. 그래서 노이즈가 충분히 차감되지 않아 곡선이 이상하게 나타납니다. 이 문제를 해결하려면 수동 모드로 바꾸어 곡선이 규칙적으로 나타날 때까지 주기 종료 값을 올려줍니다.
이제 궁금한 점이 풀리셨나요? 새로운 비디오는 실시간 PCR에 대한 여러분의 질문을 토대로 제작됩니다. 트위터나 페이스북, 홈페이지 www.lifetechnologies.com/askTaqMan에 질문을 보내주세요. 감사합니다.

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